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Johnson

--Johnson--
北京沫之东生物技术有限公司
http://www.coreab.cn
2582
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中国
--Johnson--
Johnson
18-5-20 下午1:57

基于机器学习翻译,仅供参考

练习1:查找CRISPR位点

在本练习中,您将运行Find CRISPR位点功能来查找LYP1 CDS序列上的“GN(20)GG”CRISPR网站。

选择LYP1 CDS(这个文件是geneious专用的demo数据格式,当您下载了geneious可以导入进去使用,或者导入您感兴趣领域的数据)文档,然后转到克隆→查找CRISPR位点

首先,将选项重置为默认设置。要做到这一点,点击窗口左下角的齿轮,并选择重置为默认值(如果当前设置为默认设置,这将变为灰色)。

由于我们想要在此序列中的任意位置查找CRISPR位点,因此在绑定位点旁依次选择无处不在

在Motif面板中,使用TargetPAM字段指定要搜索的gRNA序列。如果您希望评估所有潜在的CRISPR位点,请在目标框中输入N(20)。或者,如果您想要检查异地绑定的特定序列,则可以在目标框中输入确切的序列。在本教程中,我们对“GN(20)GG”指南序列感兴趣。目标序列为GN(19),PAM序列为NGG,因此目标字段类型为“GN(19)”,PAM Site字段类型为“NGG”。这些字段下方的预览显示了该目标和PAM序列的指导序列 - 即GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG

在本练习中,我们只关注“GN(20)GG”位点在序列中的位置,因此取消选中通过脱靶分析位点进行评分的选项我们要评估每个位点的活动,因此请通过检查目标活动来保持分数网站对话框现在应该如下图所示。点击确定运行搜索。

 

Geneious将使用“GN(20)GG”基序鉴定该序列上的任何CRISPR位点并对其进行注释。“查找CRISPR位点”功能每次运行的注释都被分组到一个标有CRISPR位点的新轨道中CDS中有41个“GN(20)GG”CRISPR位点。

将鼠标悬停在其中一个网站上,您将看到一个弹出式窗口,其中包含有关该网站的信息。该信息包括On-target活动评分,其是在该位点的gRNA结合和Cas9切割效率的量度,如在Doench等2014中所计算的此分数是介于0和1之间的数字,数字越高表示预期活动越高。CRISPR位点注释根据此分数自动着色,从绿色(高分)到黄色和红色(差分)的渐变。


 

要从序列中删除这些注释,请单击序列视图中曲目名称左侧的箭头,然后选择删除曲目


未完,继续第三[3]部分


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CRISPR / Cas9系统是用于基因编辑的RNA引导核酸内切酶技术。该系统需要包含与PAM(Protospacer Adjacent Motif)位点相邻的20bp靶序列的指导RNA(gRNA),以将Cas9核酸内切酶引导至切割位点。Geneious中的Find CRISPR网站工具将搜索所选基因中的gRNA(“CRISPR”)位点,并在您感兴趣的基因组中搜索脱靶结合位点。选定序列中的每个CRISPR站点根据它可能会绑定到多少个脱离目标站点以及脱离目标站点与原始序列的相似程度进行评分。 阅读指南

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问: 18-5-20 下午1:47
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最后更新: 18-5-20 下午2:28